Giriş
Diferansiye tiroid kanserleri (DTK) en yaygın malign endokrin tümörlerdir ve tüm tiroid kanserlerinin %90’dan fazlasını oluştururlar (1,2). DTK’lerinde tarama, tanı veya prognostik amaçlı kullanılabilecek biyokimyasal bir belirteç yoktur (3). Bununla birlikte, tiroglobulin, cerrahi ve/veya radyoaktif iyot (RAİ) tedavisi sonrası DTK hastalarını izlemede kullanılan önemli bir tümör belirtecidir (3). Tiroglobulin (Tg) ölçümü, tümör rezidüsü veya rekürrensinin varlığını tespit edebilmek açısından, DTK’li hastaların takibinin vazgeçilmez bir parçasıdır (1). Tg analizi için günümüzde farklı avantajları ve dezavantajları olan 3 yöntem mevcuttur (3). İkisi antijen-antikor bağlanma prensibine dayanan immün analiz (RIA ve IMA) iken bir tanesi son zamanlarda geliştirilen kütle spektrometresi (MS) yöntemidir. Bu yöntemler farklı duyarlılık, özgüllük ve interferans duyarlılığına sahiptirler (1). Günümüzde Tg konsantrasyonları için daha duyarlı olan ve ikinci jenerasyon veya high-sensitive olarak da isimlendirilen IMA yöntemleri kullanılmaya başlanmıştır [fonksiyonel sensitivite (FS) ≤0,1 ng/mL] (3). Hastanın serumunda Tg antikoru (TgAb) mevcutsa bu antikorlar özellikle immüno metrik analizler (IMA) kullanılarak yapılan Tg ölçümlerinde interferansa yol açarak yanlış düşük sonuçlara neden olabilmektedir (3). TgAb varlığında Tg konsantrasyonlarının yanlışlıkla tespit edilemeyecek düzeyde çıkması tümör rekürrensinin atlanmasına neden olabilir (4). DTK’li hastaların yaklaşık %20-30’u Tg antikorlarına sahiptir (3). Tg ölçümünde kullanılan immün analizlerin TgAb varlığında interfere olması nedeniyle, böyle bir durumda Tg’nin tümör belirteci olarak kullanılmaması gerektiği belirtilir (3). Serumda TgAb varsa ve Tg ölçüm yöntemi olarak son yıllarda geliştirilmiş olan ve TgAb interferansından etkilenmeyen kütle spektrofotometre kullanılamayacaksa, o zaman Tg yerine TgAb’nin vekil tümör belirteci olarak kullanılabileceği ifade edilmektedir (3). Pratikte TgAb değişimi DTK hastalarının takibinde kullanılmaktadır. Ancak, TgAb direkt tümör belirteci değildir ve TgAb varlığı benign veya malign hastalıklarda Tg’ye karşı ortaya çıkan immün cevabı yansıtır (5).
TgAb direkt olarak immün analizlerle veya indirekt olarak geri kazanım testleriyle tespit edilebilmektedir (6). Bununla birlikte, rehberler tarafından TgAb taramasının geri kazanım testleri yerine sensitif immün analizlerle yapılması önerilmektedir (1,6). TgAb ölçümü için günümüzde Radioimmunoassay (RIA), Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Chemiluminescence immunoassay (CLIA) ve Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) gibi çeşitli immün yöntemler mevcut olmakla birlikte en yaygın olarak CLIA veya ECLIA yöntemleri kullanılmaktadır (7). TgAb ölçüm yöntemlerinin analitik kısıtlılıkları söz konusudur. Üreticiler tarafından, standardizasyon için rehberlerde önerilen Uluslararası Referans Hazırlama (International Reference Preparation - IRP) MRC 65/93 kullanılmasına rağmen, immün yöntemler arasında analitik performanslardaki değişkenliğin yüksek olduğu gösterilmiştir (8). Yöntemler arasında duyarlılık, özgüllük, interferans eğilimi, referans ve eşik değerler açısından farklar vardır (8). Buna ek olarak, hastaların TgAb’lerinin heterojen yapısı ve epitop bölgelerindeki farklılıkların da analizler arası uyumsuzluklara katkısı olabileceği ifade edilmektedir (9). Tüm bu farklılıklar, DTK’li hastaların takibinde TgAb sonuçlarının yorumlanmasını ve yöntemler/laboratuvarlar arası karşılaştırmayı zorlaştırmaktadır.
Total tiroid ablasyonu yapılan ve TgAb pozitif olan hastalarda, Tg düzeylerinin tespit edilemez seviyelerde ve TgAb düzeylerinin düşme eğiliminde olmasının takipte güven verici değerlendirme kriterleri olduğu belirtilmektedir (10). Bununla birlikte, DTK’li hastaların takibi uygulanan tedavi şekline, TgAb pozitifliğine ve TgAb ölçümü için kullanılan yönteme göre değişebilmektedir. Takipte Tg ve TgAb düzeylerinin kullanımına ilişkin araştırmalar devam etmektedir. Sonuç olarak, günümüzde henüz en yaygın kullanılan Tg ölçüm yöntemleri IMA yöntemleridir ve bu yöntemlerle TgAb varlığında yanlış negatif sonuçlar elde edilebilmektedir. Bu nedenle, TgAb pozitif DTK’li hastaların takibinde Tg yerine vekil belirteç olarak TgAb değişimi izlenebilmektedir. DTK’li hastalarda tümör belirteci olan Tg’nin ölçümleri için TgAb interferansından etkilenmeyen MS yöntemleri analitik performansları ve klinik laboratuvarlarda uygulanabilirlikleri açısından yeterli hale gelene kadar TgAb düzeylerinin değişimi izlenmeye devam edecektir. Bu nedenle, DTK’li hastaların takibi sırasında kullanılan TgAb ve dolayısıyla Tg sonuçlarının doğru yorumlanabilmesi için interferanslar dahil TgAb ölçüm yöntemlerinin temel özelliklerinin iyi biliniyor olması gerekmektedir.
A. TgAb Prevalansı
TgAb’lerin prevalansı ölçüm için kullanılan analiz metoduna, metodun duyarlılık ve özgüllüğüne, eşik değerlerine bağlı olarak değişir (3,8). NHANES III araştırmasında kompetetif bir immün analiz yöntemi kullanılmış ve genel popülasyondaki TgAb prevalansı yaklaşık %10 olarak belirlenmiştir (4,6). Ama farklı araştırmalarda tiroid antikorlarının genel popülasyondaki prevalansı %10 ile %20 arasında değişen rakamlarda tespit edilmiştir (3). Serum tiroid antikor konsantrasyonu yüksek olan bireylerin prevalansı yaş, cinsiyet ve ırka göre değişmektedir (3,4). Örneğin kadınlarda TgAb pozitifliği daha sıktır (3,8). Gebe kadınlarda TgAb %10-20 arasında değişmektedir (3,4). DTK’li hastalarda ise prevalans %20-30 arasındadır (3,4). Ayrıca, TgAb otoimmün tiroid hastalıklarında sıklıkla (yaklaşık %60) görülmektedir (8) ve subakut tiroidit atağından sonra geçici olarak düşük antikor titreleriyle karşılaşılabilmektedir (4).
Tiroid otoantikorlarının prevalansı tip 1 diyabet ve pernisyöz anemi gibi non-tiroid otoimmün hastalıklarda artar. Yaşlanma da tiroid otoantikorlarının görülmesi ile ilişkilidir (6).
B. TgAb Ölçümü
I. TgAb Varlığı Tg Ölçümlerini Nasıl Etkiler?
TgAb pozitifliğinde Tg sonuçlarına güvenilmemesinin ve TgAb’nin vekil belirteç olarak kullanılmasının nedeni serumda TgAb varlığının Tg sonuçlarında yanlış negatifliğe yol açmasıdır (8,10,11,12). Bu durum 2 farklı şekilde açıklanmaktadır. İlki, yöntemle ilişkilidir (1). İkinci jenerasyon olanlar dahil Tg ölçümünde kullanılan IMA’larda, bir kural olarak, serumdaki TgAb’ler Tg’ye bağlandığı için, Tg’nin kitte bulunan antikorlara bağlanma bölgesi işgal edilir ve Tg bu antikorlara bağlanamaz. Sonuçta ışıma ortaya çıkmasını sağlayan antijen-antikor kompleksini oluşturamazlar (8). İkinci açıklama ise, in vivo şartlarda TgAb’lerin TgAb-Tg kompleksi oluşturarak dolaşımdaki Tg’nin klirensini artırmasıdır (1). Hastalık progresyonu ile TgAb konsantrasyon artışı ve Tg’nin paradoksal olarak azalması arasındaki ilişkinin sebeplerinden birisinin bu olduğu belirtilmektedir (1). Bu da metodolojiden bağımsız olarak Tg’nin neden güvenilmez bir tümör belirteci olduğunu açıklar (1). Sonuçta, TgAb varlığında yanlış düşük Tg sonuçları hastalık rekürrensini maskeleyebilir ve olumsuz sonuçlara neden olabilir (8).
TgAb pozitif hastalarda immün analizlerle yapılan Tg ölçümlerinde görülebilen bu negatif interferansın üstesinden gelebilmek amacıyla Tg ölçümleri için MS yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemde tripsin ile proteinler yıkıldığı için interfere edici antikorlar da yıkılmakta ve böylece interferans elimine edilmektedir (13). Ancak, TgAb varlığında güvenilir Tg ölçümü sağlayan bu MS yönteminin, günümüzde kullanılan ikinci jenerasyon immün analizlere göre dezavantajı ise kantitasyon limitlerinin (LOQ) daha yüksek olmasıdır (1). Sonuç olarak düşük düzeylerdeki Tg’leri tespit edemeyebilir. Klinik olarak aktif olan hastalarda yapılan çalışmalarda immün yöntemlerle tespit edilemez düzeylerde çıkan Tg sonuçlarının sadece %60’ı MS yöntemi ile tespit edilebilmiştir. Ayrıca MS yöntemleri rutin analizde kullanmak için teknik olarak çok daha zor ve uzun yöntemlerdir. MS yöntemlerinin duyarlılığı iyileştirilene kadar immün yöntemler ilk tercih olmaya devam edecektir (13).
Yapılan bir çalışmada, TgAb pozitif hastalarda EIA, RIA ve MS yöntemleri ile Tg düzeyleri karşılaştırılmıştır. Bu çalışmada Tg konsantrasyonları düşük ve yüksek olacak şekilde sınıflandırılmış ve TgAb pozitif olanlar içinde özellikle düşük Tg düzeylerinde EIA ile MS ve EIA ile RIA yöntemlerinin korelasyonlarının daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Bu düşük düzeydeki Tg’ler hastaların %40’ında MS yöntemiyle tespit edilemez düzeyde bulunurken RIA yönteminde tespit edilebilmiştir. Bunun 2 sebepten kaynaklandığı ifade edilmektedir. İlki, RIA’da yanlış pozitif sonuçlar olabileceği, ikincisi ise MS yönteminin alt ölçüm sınırı düşük olduğu için yanlış negatif sonuçlar olabileceğidir (14). TgAb pozitif hastalarda MS yöntemine ulaşılamadığı durumlarda RIA yöntemi Tg ölçümü için doğrulama yöntemi olarak kullanılabilmektedir. IMA’da görülen TgAb interferansının RIA’da görülmeyeceği düşünülmekle birlikte, analizin özelliklerine ve hastadaki TgAb immünojenitesine bağlı olarak bu yöntemle de yanlış düşük veya yanlış yüksek sonuçlar elde edilebileceği unutulmamalıdır (15).
TgAb varlığı ile Tg negatifliği arasındaki ilişkinin derecesine yönelik yapılan araştırmaların birinde, referans yöntem olarak MS kullanılmış ve 4 farklı immün analizin analitik performansı değerlendirilmiştir. Ancak, TgAb konsantrasyonu ile Tg yanlış negatifliğinin derecesi arasında ilişki olmadığı ve interferansın derecesinin yönteme göre ve TgAb heterojenitesine göre değişebildiği gösterilmiştir (1,13). Yüksek TgAb düzeyleri interferansa yol açmayabileceği gibi, çok düşük TgAb konsantrasyonlarında interferans görülebilmektedir (16).
II. TgAb Ölçüm Yöntemleri
Takipte önemli olan TgAb’nin ölçüm metodları Tg metodlarından daha değişkendir (4). Düşük konsantrasyonlarda olsalar bile Tg ölçümlerini interfere edebildikleri için, duyarlılık ve özgüllüğü çok yüksek tarama yöntemlerine ihtiyaç vardır (4,6). TgAb ölçümü için RIA, ELISA, CLIA veya ECLIA gibi çeşitli immün yöntemler kullanılabilmektedir (7).
RIA:
Günümüzde kullanılan RIA yöntemleri genellikle tek basamaklı yarışmalı yöntemlerdir. Poliklonal veya monoklonal insan TgAb’lerin bağlanmış olduğu tüpler içine TgAb ölçümü yapılacak serum ilave edilir. Ardından tüplere I-125 ile işaretlenmiş insan Tg’si (tracer) eklenir. Serumda yer alan TgAb’ler ve tüplerdeki solid faza bağlanmış poliklonal veya monoklonal insan TgAb’leri, I-125 ile işaretlenmiş insan Tg’sinin (tracer) epitoplarına bağlanmak için yarışırlar. Radyoaktivite düzeyi ile TgAb konsantrasyonları ters orantılıdır. RIA yönteminin duyarlılığı DTK hastalarının takibinde kullanılan Tg sonuçlarının validasyonunu değerlendirmek için yeterlidir (4).
ELISA:
ELISA metodunda kullanılan mikroplateler Tg antijenleri ile kaplanmıştır. Bu kuyucuklara serum eklenir ve serumdaki TgAb’lerin Tg’lere bağlanması için bir süre beklenir. Ardından enzimle (ALP vb.) işaretli TgAb’ler ilave edilir ve bu işaretli TgAb’lerin bir aşama önce oluşan Tg-TgAb kompleksine bağlanması için karışım tekrar inkübe edilir. Son olarak enzime uygun substrat (p-nitrophenyl phosphate vb.) eklenir ve ortaya çıkan ürün belirli bir dalga boyunda ölçülür. Serumdaki TgAb ne kadar fazlaysa ortaya çıkan absorbans o kadar fazla olur. ELISA yöntemi Tg ölçümlerinin güvenirliği açısından TgAb analizi için duyarlılığı ve özgüllüğü uygun olan yöntemlerdir (4).
İmmünometrik Analizler (IMA)
Günümüzde klinik laboratuvarlarda en çok bu yöntemler kullanılmaktadır. Ancak immün analizler farklı formlarda ve dizaynlarda olabilirler. Tipik olarak solid faz, işaretli Tg veya işaretli TgAb içerirler. Kompetetif veya non-kompetetif yöntemler olabilmektedir (4).
Kompetetif yöntemlerde solid faza (paramanyetik boncuklar vb.) kovalent olarak bağlı bulunan antikorlar serumdaki TgAb ile sınırlı miktardaki işaretli Tg’ye bağlanmak için yarışır. Tg işareti için akridinyum esteri gibi kemilüminesan bileşikler kullanılırsa yöntemin ismi immunochemiluminescence assays (ICMA) olur, floresan bileşikler kullanılırsa immunofluorescence assays (IFMA) ve radyoizotop madde kullanılırsa immunoradiometric assay (IRMA) olur (4).
Non-kompetetif yöntemler sıralı 2 basamaklı sandviç formatında yaklaşımları kullanabilirler. İlk aşamada, Tg ile kaplı paramanyetik partiküllere veya mikromanyetik boncuklara serum ilave edilince, serumdaki TgAb ile Tg bağlanır. İkinci basamakta, karışıma işaretli Tg/TgAb ve substrat eklenerek ortaya çıkan ürünün sinyali ölçülür. CLIA veya ECLIA yöntemleri kullanılan kimyasalların yarı ömrünün uzun olması, yüksek duyarlılığa sahip olmaları, otomatize olmaları ve radyoaktif atık ortaya çıkmaması gibi avantajlar nedeniyle en çok tercih edilen yöntemlerdir (4).
III. TgAb İçin Referans Yöntem ve Standardizasyon
TgAb ölçümü için günümüzde referans yöntem yoktur (4). Ancak, yöntemlerin standardizasyonu için IRP Tıbbi Araştırma Konseyi (Medical Research Council’s - MRC) 65/93 yaygın olarak kullanılmaktadır (4,6,8). Rehberler tarafından önerilen bu standartların kullanımı sonucu ortaya çıkan gelişmelere ve yöntemler arası korelasyonların iyi olmasına rağmen, analizlerin duyarlılıkları ve özgüllükleri değişkendir (4,6,8). TgAb ölçümünde kullanılan immün yöntemlerin en düşük ölçüm limiti (limit of detection - LOD), FS, referans aralık ve eşik değerleri birbirinden farklıdır. Bu değişkenliğin sebeplerinden birisi, MRC 65/93 primer standartının 50 yıldan daha fazladır kullanılıyor olması ve DTK’li değil otoimmün tiroiditli hastalardan hazırlanmış olmasıdır (16). Ayrıca, üretici firmaların bu primer standartı kullanarak hazırladıkları kendi sekonder kalibratörleri arasında da farklılıklar mevcuttur (16). Üstelik, TgAb ölçüm kitlerinde kullanılan Tg antijenindeki (Tracer) farklılıklar da TgAb ölçüm yöntemleri arasındaki uyumsuzluklara katkıda bulunmaktadır (8). Sonuç olarak, TgAb pozitif olan DTK’li hastalarda yapılan çalışmalarda, yöntemler arası TgAb sonuçlarının farklı olması şaşırtıcı değildir.
Yöntemler arasında farklılıklar görülmesinin sebeplerinden bir tanesi de TgAb heterojenitesidir. DTK hastalarında görülen TgAb heterojenitesi otoimmün tiroid hastalıklarındakine göre daha fazladır (6). Yöntemlerdeki TgAb afinitesi ve epitop özgüllüğündeki kalitatif farklılıklardan dolayı bu heterojen TgAb düzeyleri yöntemler arasında farklı elde edilebilmektedir (6). Bu nedenle özellikle DTK’li hastaların takibi açısından TgAb ölçüm yöntemlerinin özgüllüğünün geniş olması gerekmektedir (6). Ayrıca, Graves ve metastatik DTK’li hastalarda olduğu gibi serumda yüksek düzeyde Tg bulunması TgAb ölçümünü interfere edebilmektedir (6).
Sonuç olarak TgAb yöntemlerinin analitik kısıtlılıkları söz konusudur ve TgAb ölçümünde kullanılan Tg pürifikasyonundaki farklı yaklaşımlar, TgAb’lerin sağlıklı ve hasta bireylerdeki kalitatif farkları gibi nedenlerle ölçüm standardizasyonu hala tam olarak sağlanabilmiş değildir (4,8). Üreticilerin TgAb analitik performanslarını geliştirmeleri için CLSI rehberlerinin protokollerine uygun olarak iyileştirme çalışmalarına devam etmeleri gerekmektedir (8).
IV. TgAb Yönteminde Görülen İnterferanslar
TgAb ölçümünde immün analizler kullanılmaktadır ve bu yöntemler interferansa eğilimli yöntemlerdir (3). İnterferans, örnekte mevcut olan bir yapının test sonucunun gerçek değerini değiştirme etkisi olarak tanımlanır (17). İnterferanslar TgAb sonuçlarının yanlış yüksek veya yanlış düşük çıkmasına neden olabilir. Tg ölçüm sonuçlarında TgAb nedeniyle interferans görülmesine benzer şekilde TgAb ölçümlerinde de başka antikorlar veya başka yapılar tarafından interferanslar söz konusu olabilir. TgAb test sonuçlarını doğru yorumlayabilmek için TgAb ölçümünde kullanılan immün analizlerde görülen interferansları iyi anlamak gerekir. Benzer durumlar, Tg ölçümünde kullanılan immün yöntemler için de geçerlidir (4). İmmün analizlerde çok çeşitli interferanslar görülebilmektedir (17).
İmmün Yöntemlerde İnterferans Araştırması ve Çözüm Önerileri
-İnterferans araştırması klinikle test sonucunun uyumsuz olduğu durumda interferanstan “şüphe” edilmesi ile başlar (17). İmmün yöntemler, antijen-antikor bağlanma prensibi kullanıldığı için, doğası gereği özellikle antikorlarla interferansa açık yöntemlerdir (18). Heterofil antikorlar (HAb), human anti-animal antibody (HAAA), özellikle HAMA: human anti-mouse antibody ve romatoid faktör (RF) gibi endojen antikorlar interferansa sebep olabilir (4,17). Endojen antikorlarla oluşan interferanslarda yanlış düşük sonuçlar görülebilmekle birlikte genellikle yanlış yüksek sonuçlarla karşılaşılır (17). Benzer durum, ekzojen antikorlarla da ortaya çıkabilir (19). DTK hastası olan bir olguda tedavi öncesi serum TgAb testi negatif iken tedavi sonrası pozitifleştiği tespit edilmiştir (19). Hastanın IMA yöntemleriyle çalışıldığında negatif bulunan Tg testi MS yöntemiyle de çalışılmış ve sonucun gerçek negatif olduğu doğrulanmıştır (19). Bunun üzerine TgAb testinde interferans olabileceği düşünülüp detaylı araştırıldığında, hastanın yaygın değişken immün yetmezlik ve dermatomiyozit tanıları nedeniyle tedavi amaçlı subkütan IgG kullandığı anlaşılmıştır (19). Sonuçta, TgAb analizinde dışardan alınan IgG sebebiyle bir interferans olduğu ve sonucun yanlış pozitif olduğu düşünülmüştür. Tedavinin azaltıldığı haftalarda TgAb düzeylerinin azalması ile TgAb ölçüm yönteminde interferans olduğu doğrulanmıştır (19).
TgAb ölçümlerinin hastanın serumundaki antikorlardan etkilenebildiği ve yanlış yüksek sonuçlar ortaya çıkabildiğini gösteren çalışmalar mevcuttur (3). Bununla birlikte, TgAb analizlerinde yanlış negatiflikle de karşılaşılabilir. Örneğin, Hashimoto tiroiditi olduğu kanıtlanmış bir tiroid kanserli hastada, rutin TgAb analizi negatifse interferans nedeniyle yanlış negatif çıkmış olabileceği akla gelmelidir.
Endojen antikorlarla interferans şüphesi olduğunda yapılması gereken alternatif bir yöntemle ölçüm yapmaktır (17). Çünkü, üreticilerin yöntemlerde kullandığı antikorlar serumdaki TgAb’nin farklı epitop bölgelerine karşı oluşturulmuş ve farklı hayvanlardan üretilen antikorlar olabilmektedir. Dolayısıyla, kitte bulunan antikorla hastanın serumundaki interfere edici antikor bir yöntemde çapraz reaksiyon oluştururken diğerinde oluşturmayabilir (17).
Firmaların iyileştirme çalışmaları sonucu, son yıllarda immün analizlerde görülen endojen antikor kaynaklı interferanslar oldukça azalmıştır ancak tamamen ortadan kaldırılamamıştır (17). TgAb testlerinde beklenmeyen sonuçlar görüldüğünde HAb, HAAA veya RF gibi endojen antikorlar veya ekzojen antikorlar ile interferans olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır. İki bölge IMA yöntemleri diğer immün analizlere göre interferansa daha eğilimli gibi görünmesine rağmen, tüm immün analizlerde böyle bir olasılık vardır (17). Klinikle uyumsuz olan test sonuçları olduğu durumda interferans ihtimali mutlaka düşünülmelidir.
-Endojen antikorların immün analizlerde sebep olduğu interferansları araştırmada, farklı üreticiler ile karşılaştırma dışında yöntemler de kullanılmaktadır (20). Seri dilüsyon (1/2, ¼, 1/8 vb.), heterofil bloke edici tüpler ve/veya kimyasallar kullanma, RF düzeylerini ölçme gibi yöntemler bunlardan bazılarıdır (17). Bununla birlikte, TgAb interferansları ile ilişkili literatürde, incelendiği kadarıyla, bu yöntemlerin kullanıldığı bir çalışmaya rastlanamamıştır.
-Analiz öncesi faktörlerin dışlanması: TgAb ölçümünde kullanılan yöntemin içeriğinde biotin varsa ve hasta dışarıdan biotin takviyesi alıyorsa interferans ihtimali göz önünde bulundurulmalıdır (17). Serumda bulunan biotin yöntemde kullanılan biotin ile etkileşerek yanlış sonuçlara neden olabilir. Bu durumda yapılması gereken biotin kullanmayan bir yöntemle TgAb ölçümünün tekrarlanmasıdır.
Hook (Kanca) Etkisi
Hook etkisi özel bir tür interferanstır. Ancak burada interferansa yol açan neden serumdaki diğer antikorlar (HAb, HAAA, RF vb.) değil analitin kendisidir (3). Özellikle IMA yöntemlerinde görülen bir durumdur. Hook etkisi TgAb ve Tg gibi analitlerin, çok yüksek konsantrasyonlarda olduğu zaman yöntem tarafından tespit edilememeleri ve yanlış düşük düzeylerde ölçülmeleri durumudur (3). TgAb çok yüksek konsantrasyonlarda olduğunda, yöntemde kullanılan sınırlı kapasitedeki yakalayıcı antikora TgAb’nin tamamı bağlanamaz ve bir kısmı açıkta kalır. Bu nedenle çok yüksek bulunması gerekirken ya normal miktarda ya da çok düşük düzeylerde bulunabilir (6). Böyle bir hastada, Tg sonucu da tespit edilemeyecek düzeylerde bulunursa, TgAb yanlışlıkla negatif kabul edildiği için interferans yok gibi düşünülebilir ve rekürrens atlanabilir (3). Hook etkisinden şüphelenildiği durumda dilüsyonlu bir şekilde seri ölçümler yapılmalı ve bu ölçümlerde aynı kitler ve aynı cihazlar kullanılmalıdır (3).
Hook etkisini minimalize etmek için rehberler tek basamaklı yerine iki basamaklı immün analiz dizaynını önerirler (6). Pratikte kullanılan TgAb yöntemleri genellikle iki basamaklıdır ve hook etkisi çok nadir görülür. Hook etkisi görülme ihtimali olan TgAb konsantrasyonları üretici firmalar tarafından genellikle paylaşılır ve bu düzeyler hastalarda sık görülmeyecek kadar çok yüksektir. Buna rağmen, beklenmeyen sonuçlar olduğu durumda hook etkisi ile karşılaşılabilme ihtimali göz ardı edilmemelidir (6).
V. TgAb Referans Aralığı ve Eşik Düzeyleri
TgAb sonuçları bazı laboratuvarlarda eşik değerleri üzerinden rapor edilebildiği gibi, bazılarında referans aralık verilerek raporlanmaktadır. TgAb referans aralığı ve eşik değerleri metoda, metodun duyarlılık ve özgüllüğüne, hatta bu değerleri bulmak için araştırılan popülasyona bağımlıdır (4,6). Dolayısıyla yöntemler arasında çok farklı olabilmektedir. TgAb için eşik veya üst referans sınırını (URL) tanımlamak uygun referans grubu bulmak ve Tg değerlendirmesinde kullanılacak interferansı tanımlamak zor olduğu için tartışmalıdır. Ayrıca, vekil tümör belirteci olarak kullanmak üzere uygun TgAb eşik değerini belirlemek açısından da bu zorluklar söz konusudur (4,8). Referans sınırları veya eşik değerlerini belirlemek için rehberlerin önerdiği protokoller temel alınmalıdır (6).
Üretici firmaların TgAb için önerdiği referans veya eşik düzeyleri DTK için değil otoimmün tiroid hastalıkları için belirlenen değerdir (1,8). Yani, Tg ölçümlerinde interferansa yol açan TgAb düzeylerine göre oldukça yüksek seviyededir (1). Genel olarak TgAb yöntemleri düşük tespit limiti olanlar (<10 kIU/L) ve yüksek tespit limiti (>10 kIU/L) olanlar şeklinde 2 gruba ayrılır (6).
Üreticilerin önerdiği eşik düzeyleri baz alındığında “normal” olarak değerlendirilen düşük konsantrasyondaki TgAb düzeyleri bile Tg ölçümünde klinik olarak anlamlı interferanslara yol açabilir (1,16,21). Yapılan bir çalışmada, TgAb için 4 farklı immün yöntem ve RIA yöntemi karşılaştırılmış ve üreticinin önerdiği eşik değerleri temel alınmıştır (1). Sonuçta, Tg interferansına yol açtığı gösterilmiş olmasına rağmen, örneklerin yüksek bir yüzdesinde (%21-44’ünde: yönteme göre değişen yüzdeler) TgAb düzeylerinin negatif olarak kabul edildiği ifade edilmektedir (1). Sonuç olarak, Tg interferansı açısından TgAb eşik düzeyi olarak yöntemin LOD değerinin kullanılması önerilmiştir (1). Ancak bu çalışmada interferans olduğunu göstermek amacıyla interferans konusunda geçerliliği onaylanmış olmayan bir yöntem olan RIA kullanılmıştır (1). Bu konuda daha fazla araştırmaya ihtiyaç olduğu açıktır.
TgAb interferansı için eşik olarak LOD yerine FS (LOQ) kullanılmasını öneren çalışmalar da vardır (1). Bununla birlikte, LOQ kullanıldığında da analizler arasındaki uyumun optimal olmadığı çalışmalarda gösterilmiştir (1). Yaygın kullanılan TgAb yöntemleri karşılaştırılarak yapılan bir çalışmada, potansiyel olarak interfere edici TgAb varlığını göstermek için TgAb analizlerinde referans aralığı yerine LOQ değerleri kullanılması gerektiği ifade edilmektedir (13).
C. TgAb Test Sonuçlarının Yorumlanması ve Öneriler
Düşük konsantrasyonlardaki TgAb değerlerinin klinik önemi çok açık değildir (6). Sağlıklı kişilerde görülebileceği gibi tiroid cerrahisi veya RAİ tedavisine bir cevap olarak veya altta yatan bir otoimmün tiroidite bağlı olabilir (6). Düşük konsantrasyonlardaki TgAb patofizyolojik olarak önemli olmayabilir, ancak Tg testini interfere etme potansiyelinin değerlendirilmesinde düşük düzeylerde de olsa varlığı önemlidir (6). Bu nedenle, DTK hastalarının takibinde kritik olan Tg sonucunun güvenirliğini değerlendirebilmek amacıyla Tg ve TgAb ölçümleri rutin olarak birlikte bakılmaktadır (22,23).
Günümüzde TgAb ölçümleri için rehberlerin önerdiği referans materyaller kullanıldığı halde immün yöntemler henüz harmonizasyon problemini ortadan kaldıramamıştır. Bu nedenle sonuçlar çok farklı olabilir ve birbirleri ile karşılaştırılamaz (6,8). Yapılan bir çalışmada, sağlıklı 120 kişide TgAb konsantrasyonları 11 farklı immün yöntem kullanılarak karşılaştırılmış ve metodlar arası ikili karşılaştırmalardaki r değerleri 0,17 ile 0,56 arasında bulunmuştur (8). TgAb sonuçlarının yöntemler arası değişkenliği için bakılan interquartiel range değerleri %25 için 0,24-11,5 arası, %75 için 0,59-17,97 arasında bulunmuştur (8). Ayrıca bu 11 yöntemin üretici tarafından belirtilen URL değerleri 4,11 ile 11,5 arasında değişmesine rağmen, çalışmada CLSI rehberlerinin önerdiği direkt metod tekniği ile elde edilen URL değerleri 2,63 ile 4,46 arasında değişmektedir ve birbirinden çok farklıdır (8). TgAb URL’sinin DTK’li hastaların takibinde dikkatli kullanılması gerekmektedir (8). İmmün analizlerle yapılan başka bir çalışmada, yöntemler kalitatif ve kantitatif olarak karşılaştırıldığında R2 değerlerinin 0,2 ile 0,7 arasında değiştiği tespit edilmiştir (13).
Sonuç
TgAb test sonuçları yönteme ve TgAb spesifitesine bağlı olarak değişebildiği için yöntemler arasındaki sonuçlar birbiriyle karşılaştırılmamalıdır. TgAb düşük düzeylerde bile olsa Tg ölçümünde interferansa yol açabileceği için TgAb sonuçlarını değerlendiriken eşik değerler kullanılmalıdır (15). Ayrıca, DTK’li hastaların tedavi yanıtı TgAb düzeyleri ile takip edilebildiği için TgAb ölçümlerinin aynı yöntemle ve mümkünse aynı laboratuvarda yapılması önerilir (1,15). Laboratuvarların, TgAb analizinde değişiklik olması durumunda, yeni yöntemin özellikleri ile ilgili klinisyeni bilgilendirmesi gerekmektedir (6). Eski ve yeni yöntem arasındaki ilişki değerlendirilmeli ve eğer fark >%10 ise hastanın bireysel bazal düzeyinin yeni yöntemde ne olduğu belirlenmelidir (6). Tüm bunlara rağmen klinik ve görüntüleme tetkikleri ile uyumsuz TgAb sonuçları elde edildiğinde interferans olasılığı akla gelmeli ve laboratuvar uzmanı bilgilendirilerek interferans analizi yapılmalıdır.