Öz

Klinik öncesi görüntülemelerin en önemli parçalarından birisi toksisite çalışmalarıdır. Bir radyofarmasötik maddenin biyodağılımını ve toksik sonuçlarını bilmek, verilen maddenin dozunu belirlemek ve doz etkinlik, yan etki tahmini yapmak ancak bu çalışmalarla mümkün olmaktadır. Nükleer tıp pratiğinde sürekli yeni türde radyoaktif madde üretimi olduğu için toksisite çalışmaları büyük önem taşımaktadır. Radyonüklid görüntüleme ve tedavilerin avantajı biyodağılım çalışması ve hesaplama yapabilmemizdir. Bu sayede diğer ilaçlar için gerekli diğer işlem basamaklarının bazılarının (tek tek organ doz hesaplaması) bilgisayar ortamında yapılması toksisite çalışmalarında kolaylık sağlasa da yapılması gereken toksisite çalışmalarıyla ilgili bilgiler ve son yıllarda yapılan bazı örnek çalışmalar ve literatür bilgileriyle birlikte bu makale kapsamında derlenmiştir.

Giriş

Toksisite çalışmalarının anlaşılmasından önce bu konuyla ilgili bazı kavramların bilinmesi gereklidir.

Bunlardan birincisi çalışma fazlarıdır. Kabaca Faz 1 çalışmaları sınırlı sayıda kişiyi içeren kademeli doz artışı çalışmaları olup; Faz 2 çalışmaları da daha yüksek sayıda gönüllü üzerinde daha uzun süreli çalışmaları kapsar. Faz 3 çalışmaları binlerce hasta ve gönüllü katılımı olan multisentrik çalışmalardır. Faz 4 ise ruhsatlanma aşamasından sonraki çalışmalardır. Daha geniş çaplı bir güvenlik araştırması beklenmeyen saha yan etkilerinin gözlendiği aşamadır.

Anlaşılması gereken diğer kavramlar ise advers ilaç reaksiyonları ki bunlar hastalarda ortaya çıkabilecek istenmeyen cevapları kapsar ve ilacın kesilmesini, hastanede tedavi edilmesi gerektiren etkilerdir.

Farmakovijilans ise ilaç kullanımındaki yarar/zarar dengesinin kurulması ve bu dengenin hasta için en güvenli aralıkta tutulması için yapılan çalışmaların tümüdür (1).

Bu derleme kapsamında radyonüklid görüntüleme ve tedavi anlamında yapılan toksisite çalışmalarından bahsedeceğiz.

Radyofarmasötiklerle İlgili Toksisite Çalışmaları

Akut Toksisite Çalışmaları: Bu çalışmalar yüksek doz riskinin belirlenmesi için yapılır. “NOEL” olarak kısaltılan “no observed effect level” yani hiç etki görülmeyen seviye otopside tespit edilen mortalite, toksik semptomlar ve lezyonlar belirlenerek karar verilir. Bu çalışmalar daha önce kullanılmakla birlikte günümüzde yerini uzatılmış tek doz toksisite çalışmaları almıştır. Farklı olarak radyofarmasötikler için yapılmayan bazı çalışmalar ise şunlardır: subakut ve kronik toksisite çalışmaları (tek veya birkaç doz halinde verildiği için), teratojenite (üreme çalışmaları) (hamilelere verilmediği için), genotoksik (mutajenik) çalışmalar (bir veya birkaç doz verildiği için), karsinojenik çalışmalar (radyasyonun bilinen karsinojenik etkisi dozimetri konusuyla birlikte değerlendirildiği için).

Radyofarmasötiklerde tüm komponentler prekürsör ve sonuç radyofarmasötik aktif içerik birlikte enjekte edilir. Prekürsör madde (veya prekürsör hidroliz ürünü) klinik öncesi çalışmalar için kullanılmalıdır. Bir karışıklık durumunda prekürsörün farmakolojik aktivitesi (örneğin, reseptöre afinite gibi) ve radyoişaretli bileşik için karşılaştırma bilgisi gereklidir. Eğer etkili saflaştırma gereken sayısallaştırma çalışmaları yapılacaksa radyoaktif bileşiğin içeriklerine ayrılması gerekir. Bu HPLC ile radyofarmasötiğin aktif bileşenleri ayırılması işlemini içerir. Eğer radyoaktif bir izotop yerine stabil bir izotopla çalışılıyorsa [flor-18 (¹⁸F) yerine ¹⁹F] radyoaktif olanın kullanılması gerekir. Uyarlanmış risk değeri ile ilgili olarak (kanser riski <1/100000 yaşam boyu) toksikolojik kaygı eşiği değeri olarak 1,5 mg/gün alım genotoksik saflık için kullanılır. <100 mg altında radyofarmasötiklerin satış ve insan klinik çalışmaları için klinik dışı güvenlik çalışmalarında ICH kılavuz M3 (R2) kullanılır. Tipik olarak x100 katı doz otuz hayvanda (kemirgenler) ve her cinsten 10 hayvanla aynı gün ve 14 gün sonra olacak şekilde (hematolojik, klinik biyokimya ve histopatoloji) çalışmaları içermelidir. Hayvan türlerinde NOEL güvenlik farmakolojik çalışmaları (insan çalışmalarındaki maksimal dozun x100 katı dozunda) önerilmektedir. Proteinler gibi daha büyük moleküllerde Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) çalışmaları <30 mmol sınırını almaktadır. Radyofarmasötiklerde ayrıca çok geniş biyodağılım çalışması da elde edilmektedir. Bu sayede hedef organlar seçilerek daha maliyetli olan genişletilmiş tüm organları içeren histopatolojik analizler yapılması gerekmiyor. Peptitler, proteinler ve tedavi uygulamaları için radyofarmasötik formatında 100 mg’dan fazla madde uygulanması gerekebilir (2).

Tedavi çalışmalarında veriliş yolu aynı olmalıdır (3, 4). Deney hayvanları üç grup tedavi ve bir kontrol olmak üzere ayrılırlar (10 hayvan/cinsiyet/doz kemirgenler ve 3 hayvan/cinsiyet/doz kemirgen dışı hayvanlar) ve histopatolojik, klinik biyokimya ve hematolojik testler her hayvanda uygulanır ve süre insandaki süreden daha uzun olmalıdır. En düşük NOEL düzeyi en hassas tür için tespit edilir ve insan için risk değerlendirilmesi yapılır.

Üreme çalışmalarında üç tedavi bir kontrol kolunda her cinsiyetten yirmi hayvan (erkekte çiftleşmeden 30 gün önce ve dişide 14 gün önce ve 7 gün sonra) kullanılır. Erkekte üreme organlarının histolojisi ve sperm analizi yapılır.

Teratotoksisite ve embriyotoksisite çalışmalarında da bir kemirgen (rat) ve bir kemirgen dışı (tavşan) yumurta implantasyonu sonrası organogenez arasında (ratta 15-17. ve tavşanda 18. gün) tedavi edilir. Malforme olanların yamyamlığını önlemek için doğumdan bir gün önce hayvanlar sakrifiye edilir. Fetüsler herhangi bir eksternal malformasyon ve yumuşak doku ve iskelet sistemi bakımından muayene edilir. Perinatal ve postnatal toksisite çalışmaları için dişi ratlar 7. günden memelerinin çıkış gösterdiği doğumdan sonraki 21. güne kadar tedavi edilir ki bu period organogenez, malrotasyon, doğum ve laktasyonu içerir. Ayrıca ikinci jenerasyonun üretimi de incelenir.

Mutajenik potansiyel in vivo ve in vitro olarak toplam en az üç veya dört testle incelenir. Ames testi histidin kusurlu mutant bakteri ve ters mutasyon yapan bir mutajen ile değişik gen mutasyon ve baz tamir sorunlarını ve frameshift mutasyonlarını gösterir ki test yapılması hızlı olmakla birlikte prokaryotlardan insana uyarlanması ve değerlendirilmesi zordur.

Diğer test ise memeli hücre kültürüdür. Genelde fare lenfoma hücreleri kullanılır ve bir mutajenik ajanla timidin kinaz lokusunda indüklenen triflor timidin toksisitesine mutant hücre direnci oluşur. Bir alternatif test ise metafaz analizinde kromozomal aberasyon oluşturularak mikroskobik gözlem ile kromozomların tedavi sonrası sayılması ve yapısının incelenmesidir.

Bir in vivo test de yapılmalıdır. Kemik iliği hedef organ olup rat veya fareler kullanılır. Kromozomal aberasyonların indüksiyonu ya metafaz analizi veya mikronükleus araştırması ile polikromatik eritrositlerde yapılır. Şüphe varlığında ek panel tamamlayıcı çalışmalar da yapılmalıdır.

Her karsinojen bir mutajen olmadığı için insanda uzun süreli tedavi planlandığında (>3-6 ay) veya mutajenite çalışmaları pozitif veya kuşkulu olduğunda tüm kısa çalışmalarda yapılmalıdır. İki tür kullanılır. Rat ve fareye 2 yıl boyunca tedavi verilir. Kontrol ve tedavi grubunda tümör insidansı histopatolojik olarak araştırılır (3, 5).

Daha geniş gruplarda (her cinsten >50) sex çalışması yapılır ve her tür için >500 hayvan kullanılır ki bu çalışmalar pahalı ve zaman alıcıdır (3, 6).

Lokal tolerans testi ilaç standart dışı bir yolla verildiğinde (oral yerine dermal intravenöz gibi) tavşan veya köpek tercih edilerek insanda uygulanması planlanan yolla verilerek örneğin intravenöz yol tercih edilecekse perivenöz ve intraarterial olarak uygulamaları da içeren testler yapılmalıdır (3, 7).

Yeni bir yönteme bağlı safsızlık veya daha önce görülmeyen parçalanma ürünlerinin oluşması durumunda da 1-3 aylık toksisite testleri ve iki in vitro mutajenite testi yapılması gerekir (3, 8).

Hamilelik veya laktasyonda hiçbir test yapılmamalıdır. Kadınların maruz kalma durumu dışında segment 2 veya 3 perinatal ve postnatal toksisite çalışmaları gerekli değildir.

Temel biyoulaşılırlık ve dağılımdır. İlaç over veya testis dokusunda yüksek birikim gösterecekse işaretlenmiş molekülün test edilmesi gereklidir.

Genellikle testler işaretlenmemiş molekülde yapılır ama uzun yarı ömür durumunda işaretlenmiş molekülde test yapılması gerekir.

Daha önce kullanılmamış bileşiklerde radyoaktivitenin mutajenitesi in vitro testlerle araştırılmalıdır.

Radyonüklid tedavilerde vektör olarak şelatör kullanıldığında ve hastada kullanımında yüksek dozlara ulaşılacaksa akut toksisite çalışmaları yapılmalıdır. Subakut ve kronik toksisite çalışmaları işaretlenmemiş bileşikte mutlaka yapılmalı ancak işaretlenmiş bileşikte olgu bazlı değerlendirilmelidir. Bu çalışmalarda esas olan insandaki kullanımındaki süre ve tedavi planıdır ve işaretleyici ile ilişkili organa özgül toksisiteyi değerlendirilir.

İnsanda beklenen yaşam süresinin çok kısa olması hali dışında yüksek doz tedavi çalışmalarında mutajenite çalışmaları çok önemlidir, çünkü genotoksik veya karsinojenik risk kabul edilemez. Tüm test paneli uygulanmalı ve insan lenfoma hücre kültüründe in vitro radyasyonun klastojenik aktivitesi değerlendirilmelidir. Lokal tolerans testi de ayrıca önemlidir. Çünkü antikanser ilaçların oluşturduğu lokal toksisite ile birleşince problemlerin artmasına neden olabilir.

Safsızlık radyofarmasötiklerde sentez sırasında veya parçalanma ürünleri ile olur. Bu safsızlık işaretlenmemiş bileşikte yapılmalı ve insana verilmesi planlandığında toksikolojik karakteri dokümente edilmelidir. Radyofarmasötik safsızlıkları radyoliz nedeniyle olabilir ve bu durumda radyolitik parçalanma ürünlerinin toksisitesi durumu ve korunma süresini ortaya koymak için gösterilmelidir.  Eksternal radyasyon kullanılarak radyolitik bozunma ürünleri üretilir ve sayısal olarak işaretlenmiş bileşikteki gibi olup olmadıkları en azından sayısal olarak kontrol edilmelidir. Hem intakt hem parçalanmış kimyasallarda akut ve subakut toksisite testleri tam panel mutajenite testi ile mutajenik potansiyel ve karsinojenik risk ortaya konulmalıdır. Bir güvenlik faktörü NOEL insanda belirlenerek molekülün litik kinetikleri ortaya konur ve bozunum safsızlıklarının ortaya çıkmaması için bir raf ömrü bulunabilir. Faz 1 çalışmalarında sadece akut ve subakut çalışmalar ve en az iki mutajenite testi (genellikle ames) ve bir de kromozomal mutasyon olmak üzere in vitro metafaz analizi veya in vivo mikronükleus analizi yapılır (9). Faz 2 ve 3 klinik çalışmalarda tüm klinik öncesi çalışmalar gereklidir.

Hedeflenmiş radyonüklid tedavide (TRT) klinik öncesi radyobiyolojik çalışmalar hız kazanmıştır (10, 11, 12). Her ne kadar eksternal radyasyoterapinin etkileri iyi bilinse de TRT için farklı faktörler tanımlanmıştır. Bunların arasında biyolojik sonuçlar, radyonüklid emisyonu, hedef vektörler ve ekspresyon-lokalizasyonları nedeniyle farklı doz aralıkları sayılabilir. Tanım olarak kanser hücreleri gibi spesifik hücreleri hedefleyip parçalayan radyoaktif maddelerle sistemik tedavidir. Doz ya verilen aktivite ya da absorbe edilen radyasyon dozu olarak ifade edilir ki her ünite başına iyonizan radyasyondan etkilenen enerji olarak ifade edilen radyasyon absorbe edilen doz (Gy) birim olarak tercih edilmelidir. TRT kimyasal kimlik, taşıyıcı vektör özellikleri ve kimyasal ve radyokimyasal bilgilerine sahip olmalıdır. Metodolojik parametreler doğru ifade edilmeli ve tedavi etkinliği ve biyolojik sonuçların açıklanması için testler dahil edilmelidir. Klonojenik test altın standart olup tüm in vitro tedavi çalışmalarına mümkün olduğunca eklenmelidir (13). Bu test bir hücrenin yediden fazla bölümde yer alabilmesini değerlendirip TRT için genellikle plantasyon öncesi (ışımadan önce) ve sonrası olabilir. In vivo çalışmada ise tüm bulgular kilo kaybı, iyi hal, ideal organ fonksiyonları (örneğin, karaciğer, böbrek ve kemik iliği) incelenir ve potansiyel toksisite ve tolerabilite yönünden değerlendirilir. Mümkün olduğunca dozimetri hesapları ve görüntüleme bilgileri ve biyodağılım çalışmaları yapılmalıdır. Böylece tedavi planı daha doğru yapılır ve toksisite minimalize edilir.

Bu kısma kadar toksisite ile ilgili kavramları inceledik ve bundan sonraki kısımda son yıllarda yapılan radyofarmasötik toksisite çalışmalarına örnekler vereceğiz.

Örnek 1: Gastrik adenokarsinomlarda ⁸⁹Zr-Zr DFO-NY005 isimli immüno-PET ajanı bir klinik öncesi ve ön çalışma ile değerlendirilmiş, Claudin 18.2 hedefli bu yöntem hem ksenogreft modelinde farede hem hastalarda kanser hücrelerinde yeterli tutulum ve stabilite değerleri sergilemiş ve tedavi ile de etkinliği gösterilmiştir (14). Aynı çalışmada öncelikle karaciğer ve dalak ve böbrekte dağılım blokaj ile baskılanmış ve toksisite çalışmaları sonucunda hiçbir denekte yan etki veya klinik farmakolojik etki gözlenmemiştir.

Örnek 2: Tedavi için kullandığımız diğer bir madde olan prostat spesifik membran antijeni (PSMA) için geliştirme çalışmaları kapsamında b3 aminoasid manipülasyonlu daha etkin ve güvenilir yeni bir hedeflenmiş ligand oluşturulmuştur (15). Klinik öncesi çalışmalarla ⁶⁸Ga-PSMA-HK4 isimli bu ajanın daha yüksek etkinlik gösterdiği ve ilk insan çalışmasında da daha düşük tükürük bezi tutulumu gösterdiği kanıtlanmıştır (16). Ayrıca diğer bileşiklere göre en yüksek tümör böbrek oranı sağlanmıştır. 

Örnek 3: Diğer bir klinik öncesi çalışmada ise prostat kanserinde PSMA tutulumunun artırılması için ultrasonografi ile yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem ilaç tutulumunu artırmış ve doku hasarı için alınması gereken önlemlerin azaltılmasını sağlamıştır  (17). Bu yöntemde gaz doldurulmuş mikrobalonlar ultrasonun permeabilitesi ile kombine edilmektedir. ¹⁸F-PSMA-1007 ajanının dokulardaki dağılımı etkilenmezken yöntem güvenilir ve ağrısızdır (18).

Örnek 4: Diğer bir ajan CDH3 hedefli yeni bir teronostik modeli olup; bu çalışmada geliştirilen ⁸⁹Zr-Zr DFO-11E10C11 ve ¹⁷⁷Lu-Lu DOTA-11E10C11 triple negatif meme kanserinde tümör büyümesini belirgin baskılamış, aynı zamanda hematolojik toksisite ve normal organlarda doku hasarı oluşturmamıştır (19). Bu çalışmada ayrıca tedavi grubu 155 günlük %100 sağ kalım oranı göstermiş ve farelerde 11E10C11 monoklonal tedavi etkinliği gösterilmiş olup; organlarda patolojik bulgu izlenmemiştir, hematolojik parametreler normal aralıkta seyretmiştir.

Örnek 5: Bir başka çalışmada kütle sitometrisi (Cy TOF) yönteminin hücre düzeyinde non-radyoaktif farmasötiklerin tutulumu araştırılmış ve CD30 hedefli (lenfomada artış gösteren bir reseptör) bir immünokonjugat olan ve tedavi amacıyla kullanılan ¹⁷⁷Lu-Lu DOTA-cAC10 veya ¹⁷⁵Lu-Lu DOTA-cAC10 ile alternatif bir biyodağılım çalışması elde edilmiştir (20, 21, 22).

Örnek 6: Tedavi alanında bir başka umut vaat edici radyofarmasötik olan ⁶⁸Ga-Ga FAPI-04’ün bir alternatifi olan DOTAGA.Glu.(FAPI)₂ sitogenetik tümör modelinde test edilmiş; molar doz optimizasyonu ile karaciğer akümülasyonu azaltılmış ve ¹⁷⁷Lu bileşiği ile farede tedavi etkinliği sağlanmakla birlikte sistemik toksisite oluşmamıştır (23). Klinik olmayan toksikoloji çalışmaları iyi laboratuar çalışması ile uyumlu ortamlarda yapılmalı ve klinik faz çalışmaları için başlangıç dozu NOEL ile değerlendirilmelidir (24). Çalışmalar tüm gruplarda 2. ve 14. günü kapsamalıdır (25). Ayrıca klinik dozun 1000 katı doz kullanılmalıdır. İkinci bir yaklaşımda da yedi gün boyunca süren tekrarlı toksisite çalışmaları olabilir (24). FDA’nın radyofarmasötikler için yayınladığı kılavuza göre uzatılmış tek doz toksisite protokolüne göre 14 gün boyunca vücut ağırlığı, nekropsi, klinik bulgular, biyokimyasal, hematolojik ve histopatolojik testleri içermelidir (26).

Sonuç

Sonuçta klinik öncesi çalışmaların en önemli kısımlarından birisi toksisite çalışmaları olup bu çalışmalar bizim başarılı şekilde klinik geçişimizi (translasyon) sağlamaktadır.