Öz

Teranostik konsepti, aynı moleküler hedefe yönelik tanısal ve terapötik radyofarmasötiklerin entegrasyonu ile kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarında devrim yaratmıştır. Yeni teranostik ajanların laboratuvardan kliniğe (translasyonel) aktarılmasında, küçük hayvan modelleriyle yapılan klinik öncesi (preklinik) moleküler görüntüleme çalışmaları kritik bir eşiktir. Bu derlemede, yeni radyofarmasötik geliştirme süreçlerinde klinik öncesi mikro-tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve mikro-pozitron emisyon tomografi (PET) sistemlerinin rasyonel kullanım alanları, metodolojik standartları ve literatürdeki güncel translasyonel başarı öyküleri incelenmiştir. Teranostik çiftlerin geliştirilmesinde mikro-görüntüleme; in vivo stabilitenin gösterilmesi, biyodağılımın haritalanması, tümör kinetiğinin belirlenmesi ve kritik organ dozimetrisinin hesaplanması amacıyla kullanılmaktadır. Görüntüleme protokollerinin optimizasyonu (dinamik vs. seri statik), cihaz kalibrasyonları, yüksek spesifik aktivite gereksinimi, enjeksiyon rotaları (intravenöz, intraperitoneal, intranazal) ve anestezik ajanların farmakokinetik üzerindeki etkileri klinik öncesi standardizasyonun temel taşlarını oluşturmaktadır. Literatürde prostat spesifik membran antijeni (PSMA) (PSMA-617) ve fibroblast aktivasyon proteini (FAP) (FAPI-46) hedefli ajanların klinik başarıya ulaşmasında bu klinik öncesi basamakların rolü büyüktür; günümüzde ise insan trofoblast hücre yüzey antijeni 2 ve Nectin-4 gibi yeni nesil hedefler öne çıkmaktadır. Klinik öncesi PET ve SPECT görüntüleme, potansiyel teranostik ajanların in vivo davranışlarını insan öncesi aşamada öngören en güvenilir yöntemlerdir. Erken evrede saptanan in vivo instabilite durumları (örneğin, serbest iyot-124 ayrışması gibi) gereksiz insan çalışmalarını önlerken, başarılı klinik öncesi tasarımlar geleceğin rutin klinik ajanlarının kapısını aralamaktadır.

Giriş

Teranostik terimi, İngilizce tedavi (therapy) ve tanı (diagnosis) kelimelerinin birleşiminden türetilmiş olup, aynı moleküler hedefe bağlanan tanısal ve terapötik radyofarmasötiklerin hastalık yönetiminde eş zamanlı veya ardışık olarak kullanılmasını ifade eder. Bu kavram doğrultusunda, öncelikle gerçekleştirilen moleküler görüntüleme ile hedeflenen reseptörün tümör dokusundaki ekspresyon düzeyi ve hastalığın anatomik yaygınlığı nesnel olarak değerlendirilir. Elde edilen görüntüleme verileri sayesinde, aynı hedefe bağlanacak olan tedavi radyofarmasötiğinin tümörde ne düzeyde tutulum göstereceği önceden öngörülebilmektedir. Böylelikle teranostik yaklaşım, tedavi etkinliğinin henüz uygulama aşamasına geçilmeden tahmin edilmesine ve dolayısıyla tedavinin kişiselleştirilmesine olanak tanır. Tanısal aşamayı takiben, aynı hedefi rehber edinen beta (b) veya alfa (a) yayıcı terapötik radyonüklidler ile hedefe yönelik tedavi uygulanır.

Günümüzde teranostik konseptine dayalı yeni radyofarmasötiklerin geliştirilmesi süreci ivme kazanarak devam etmektedir (1, 2). Bu moleküllerin geliştirilme ve translasyonel tıp aşamalarında, klinik öncesi (preklinik) tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve pozitron emisyon tomografi (PET) sistemleri ile yürütülen küçük hayvan görüntüleme çalışmaları kritik bir yer teşkil etmektedir. Bu derleme makalesinde, klinik öncesi SPECT ve PET sistemlerinin yeni ajan geliştirme süreçlerinin hangi aşamalarında ve ne şekilde kullanılabileceği güncel literatür ışığında özetlenmiştir.

Yeni Radyofarmasötik Geliştirme Süreçleri ve In Vitro/In Vivo Değerlendirmeler

Teranostik amaçla kullanılacak yeni radyofarmasötiklerin geliştirilme sürecinde ilk adım; tümör hücresinde veya tümör mikroçevresinde uygun bir biyobelirtecin (hedefin) seçilmesi ve bu hedefe yüksek afinite ile bağlanabilecek sentetik bir ligandın üretilmesidir. Sonraki aşamada bu ligand, uygun bir gama (g) veya pozitron (b⁺) yayıcı radyonüklid ile işaretlenir. Laboratuvar ortamında radyokimyasal saflığı ve stabilitesi doğrulanan bu potansiyel görüntüleme ajanının, hücresel çalışmalar aracılığıyla in vitro ortamda hücre içi stabilitesi ve hedef reseptöre bağlanma kinetiği değerlendirilir (3, 4).

Tüm bu basamakları başarıyla tamamlayan yeni bir görüntüleme radyofarmasötiğinin bir sonraki test ortamı, uygun hayvan modelleri üzerinde gerçekleştirilecek SPECT veya PET görüntülemeleridir. Bu aşamada; ajanın fizyolojik biyodağılımı, olası toksisiteye veya yan etkilere yol açabilecek hedef dışı organ tutulumları ve nihayetinde farklı tümör modellerindeki tutulum düzeyleri ile tümör-arka plan oranları kantitatif olarak analiz edilebilir. Geliştirilen radyofarmasötik bir gama yayıcı radyonüklid içeriyorsa mikro-SPECT, bir pozitron yayıcı radyonüklid içeriyorsa mikro-PET görüntüleme modalitesi tercih edilmelidir.

Teranostik geliştirme sürecindeki bir sonraki basamak ise teranostik çiftin tedavi bileşeninin tasarlanmasıdır. Bu aşamada, aynı hedefe bağlanan ligand bu kez beta veya alfa yayıcı terapötik radyonüklidler ile işaretlenir. Tedavi radyofarmasötiğinin terapötik etkinliğinin öngörülmesi sürecinde, ex vivo biyodağılım ve diseksiyon çalışmalarının yanı sıra, eğer kullanılan terapötik radyonüklid eş zamanlı bir gama bozunumu da sergiliyorsa [örneğin, lutesyum-177 (¹⁷⁷Lu) gibi], mikro-SPECT görüntüleme çalışmalarından yararlanılır. Bu çalışmalarda temel amaç; radyofarmasötiğin in vivo biyodağılımını belirlemek, kritik organların soğurduğu dozları hesaplamak ve ajanın tümördeki kalış süresini (retansiyonunu) saptayarak terapötik açıdan yeterli tümör dozlarına ulaşıp ulaşılamayacağını araştırmaktır (4, 5).

Yeni bir teranostik çiftin geliştirilmesi süreçlerinde mikro-SPECT ve mikro-PET çalışmalarının temel kullanım amaçları şu şekilde sıralanabilir:

• In vivo biyodağılımın kantitatif olarak değerlendirilmesi,

• In vivo kimyasal ve metabolik stabilitenin izlenmesi,

• Terapötik etkinliğin ve tümör kinetiğinin öngörülmesi,

• Kritik organ ve tümör dozimetri çalışmalarının yürütülmesi.

Görüntüleme Protokollerinin Optimizasyonu ve Zaman Faktörü

Teranostik çiftlerin geliştirilmesi aşamasında, yeni görüntüleme radyofarmasötiğinin tümörde optimal tutulum gösterdiği zaman diliminin belirlenmesi ve net biyodağılım profilinin ortaya konulabilmesi amacıyla, kullanılan radyonüklidin fiziksel yarı ömrü ve ligandın biyolojik yarı ömrü göz önünde bulundurulmalıdır. Bu doğrultuda dinamik görüntüleme protokollerinin veya farklı zaman dilimlerinde gerçekleştirilen seri (çok zamanlı) statik görüntülemelerin yapılması gereklidir.

Örneğin, insan trofoblast hücre yüzey antijeni 2 (Trop-2)’ye bağlanan monoklonal antikor yapısındaki bir ligandın, uzun fiziksel yarı ömre sahip bir radyonüklid ile işaretlenmesiyle elde edilen ⁶⁴Cu-NO-TA-hIMB1636 molekülünün mikro-PET çalışmasında; tümördeki tutulum düzeyini ve tümörde kalış süresini doğru değerlendirebilmek adına enjeksiyon sonrası 4., 24. ve 48. saatlerde seri görüntüler alınmıştır (5). Bu geniş zaman aralığı, hem radyonüklidin fiziksel yarı ömrünün hem de monoklonal antikoron hedef reseptöre uzun süreli bağlanma ve klerens potansiyelinin bir gerekliliğidir.

In vivo Stabilitenin Kritik Önemi ve Başarısız Adayların Elenmesi

In vitro ortamda stabilitesi kanıtlanmış yeni bir radyofarmasötiğin in vivo sistemlerde de yapı bütünlüğünü koruyup koruyamadığının belirlenmesi, klinik öncesi görüntülemenin en hayati amaçlarından biridir. Geliştirilen ajan in vivo ortamda hızla metabolize olur veya kimyasal modifikasyona uğrarsa, hedef reseptöre bağlanma afinitesi dramatik şekilde düşecek ve tanısal/tedavi edici etkinliği azalacaktır. Daha da önemlisi, bağından ayrışan serbest radyonüklidler veya ortaya çıkan farklı metabolitler, sağlıklı dokularda birikerek istenmeyen toksisitelere yol açabilir.

Bu duruma çarpıcı bir örnek olarak, yazarların daha önce in vitro ortamda yüksek stabilitesini gösterdikleri iyot-124 (¹²⁴I) ile işaretli altın nanopartiküllerin, bir ksenogreft fare modelinde in vivo stabilitesini değerlendirdikleri çalışma verilebilir. Enjeksiyon sonrası alınan seri mikro-PET görüntülerinde, 20. dakikadan itibaren hayvanların tiroid bezinde ve karaciğerinde serbest ¹²⁴I ayrışmasına bağlı belirgin bir radyoaktivite birikimi izlenmiştir (6). Bu bulgu, nanopartikül ile ¹²⁴I arasındaki bağın in vivo koşullarda stabil olmadığını net bir şekilde ortaya koymuştur. Klinik öncesi görüntüleme sayesinde elde edilen bu olumsuz veri doğrultusunda, söz konusu nanopartikülün insanlarda ilk uygulama (faz) çalışmalarına geçilmemiş; böylece hem kaynak israfı hem de potansiyel bir klinik risk erkenden önlenmiştir.

Klinik Öncesi Merkezlerde Standardizasyon ve Metodolojik Esaslar

Teranostik geliştirme sürecinde mikro-PET ve mikro-SPECT çalışmalarına yeni başlayacak olan merkezlerde belirli metodolojik standartların sağlanması, verilerin güvenilirliği açısından büyük önem arz etmektedir. Aksi takdirde, klinik translasyon aşamasında yetersiz veri setlerine veya yanlış yorumlamalara yol açacak sonuçlara ulaşılması kaçınılmazdır.

1. Cihaz Kalibrasyonu ve Fantom Çalışmaları: Kullanılacak görüntüleme sisteminin, söz konusu radyofarmasötiğin içerdiği spesifik radyonüklid için çapraz kalibrasyonunun yapılmış olması ve duyarlılık/çözünürlük analizlerinin fantom çalışmaları ile doğrulanması kritik bir öneme sahiptir. Bu standardizasyon, özellikle hipofiz ve tiroid gibi milimetrik küçük organlardaki fizyolojik tutulumların ve küçük tümör odaklarının doğru kantifiye edilmesi açısından vazgeçilmezdir.

2. Doz ve Spesifik Aktivite Seçimi: Uygulanacak radyofarmasötik dozu ve görüntüleme protokolleri, literatürdeki benzer kimyasal yapıdaki ajanlar referans alınarak tasarlanmalıdır. Deney hayvanlarına güvenle uygulanabilecek intravenöz enjeksiyon hacimleri oldukça sınırlı olduğundan (örneğin, fareler için maksimum 100-200 μL), hayvanı kütlesel (soğuk ligand) olarak satüre etmeden yeterli radyoaktiviteyi (sıcak ligand) enjekte edebilmek adına yüksek spesifik aktivitelerin (molar aktivite) tercih edilmesi gerekmektedir.

3. Farmakokinetik ve Biyodağılım Analizleri: Biyodağılımın ve organ klerenslerinin net gösterilebilmesi için ideal protokol; enjeksiyon sonrasındaki ilk 1 saatlik süreçte kesintisiz dinamik görüntüleme yapmak, ardından daha geç zaman dilimlerinde statik görüntülerle süreci desteklemektir. Dinamik görüntüleme; emilim, dağılım, metabolizma ve eliminasyon süreçlerini gerçek zamanlı izlemek ve dolaşımdan hızlı temizlenen ajanların tanısal performansını saptamak için idealdir. Monoklonal antikorlar gibi uzun yarı ömre sahip makromoleküller için ise geç statik görüntüler daha rasyoneldir. Görüntüleme sekanslarının tamamlanmasının ardından, hayvanların sakrifikasyonu ve organ diseksiyonu (organ harvesting) yapılarak gama sayıcılarda (gamma counter) gerçekleştirilen ölçümler, görüntülemeden elde edilen kantitatif verilerin doğrulanmasını [gerçek yüzde enjekte edilen doz/gram (%ID/g) değerlerini] sağlar. Ek olarak, belirli zamanlarda alınan kan ve idrar örneklerinin kütle spektrometrisi, florometri, spektrofotometri veya gama sayıcılar ile analizi, dolaşımdan temizlenme kinetiğini ve üriner/hepatobilyer atılım dinamiklerini aydınlatır.

4. Enjeksiyon Teknikleri: Teranostik ajan çalışmalarında standart yaklaşım intravenöz bolus enjeksiyondur. Ancak özellikle nörolojik reseptör çalışmalarında radyofarmasötiğin plazmada kararlı bir konsantrasyonda kalması isteniyorsa sürekli infüzyon protokolleri gerekebilir. İntranazal veya retro-orbital uygulamalarda lokal doku hasarını ve hacim yükünü önlemek için spesifik aktivite optimize edilmelidir. İntraperitoneal tümör modellerinde ise ajanın doğrudan intraperitoneal yolla uygulanması hedefe yönelik lokal tutulum performansını değerlendirmek açısından avantaj sağlayabilir (7, 8, 9).

5. Anestezi Yönetimi: Hayvan enjeksiyonu ve görüntüleme prosedürleri genellikle genel anestezi altında yürütüldüğünden, seçilen anestezik ajanın (örneğin, izofluran, ketamin/ksilazin) kardiyak debi, organ perfüzyonu ve dolayısıyla radyofarmasötiğin biyodağılımı üzerindeki olası etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. Anestezi süresi ve derinliği farmakokinetiği doğrudan etkileyebileceğinden, tüm deney gruplarında tamamen eşit ve standart anestezi koşulları sağlanmalıdır.

Klinik öncesi mikro-PET ve mikro-SPECT çalışmalarında metodolojik standardizasyon parametreleri Tablo 1’de özetlenmiştir.

Literatürdeki Güncel Translasyonel Başarı Öyküleri ve Geleceğin Hedefleri

Klinik öncesi görüntülemenin en aktif ve başarılı şekilde entegre edildiği teranostik süreçlerin başında prostat spesifik membran antijeni (PSMA) hedefli ajanlar gelmektedir. Ruigrok ve ark. (9), PSMA I&T ve PSMA-617 ligandlarının ¹⁷⁷Lu ile işaretli formlarının biyodağılımını ve tümör tutulum düzeylerini, PSMA ekspresyonu gösteren bir tümör modelinde karşılaştırmışlardır (10). Farklı zaman dilimlerinde elde ettikleri seri mikro-SPECT/BT görüntülemeleriyle; ¹⁷⁷Lu-PSMA-617’nin tümörde PSMA I&T ile benzer ve yüksek bir tutulum sergilediğini, ancak böbrek ve tükürük bezi absorbe dozlarının anlamlı derecede daha düşük olduğunu ortaya koymuşlardır. Bu preklinik veriler, ajanın insan çalışmalarındaki yüksek terapötik indeksinin erken bir kanıtı olmuştur.

Son yıllarda klinik öncesi moleküler görüntülemenin kılavuzluk ettiği bir diğer devrimsel grup ise fibroblast aktivasyon proteini (FAP) hedefli teranostikler olmuştur. İlk geliştirilen türevlerden FAP inhibitörü (FAPI)-02 ve FAPI-04’ün FAP eksprese eden tümörlerde yüksek düzeyde tutulum gösterdiği ve vücuttan hızlı temizlendiği hayvan çalışmalarıyla kanıtlanmıştır (10, 11). Bu gözlemin hemen ardından, radyonüklid tedavi için tümörde daha uzun kalış süresine (retansiyona) sahip moleküller tasarlanması amaçlanmış; FAPI-46 ve FAPI-2286 türevlerinin tümör dokusunda daha uzun süre kaldığı yine hayvan modellerinde yürütülen preklinik SPECT/PET çalışmalarıyla ortaya konulmuştur (12). Bu klinik öncesi verilerin ışığında, günümüzde ⁶⁸Ga-PSMA-617 ve ¹⁷⁷Lu-PSMA-617 ile birlikte ⁶⁸Ga-FAPI-46 ve ¹⁷⁷Lu-FAPI-46 çiftleri klinik pratikte yaygın ve güvenle kullanılan birer rutin radyofarmasötik haline gelmiştir.

Günümüzde preklinik çalışmalara sıklıkla konu olan ve yakın gelecekte translasyonel uygulamalarını, klinik faz çalışmalarını sıklıkla göreceğimiz iki yeni hedef ise Trop-2 ve Nectin-4’tür (13, 14). Bu iki hedefe yönelik geliştirilen yeni nesil teranostik ajanların (antikor-ilaç konjugatları benzeri radyofarmasötik tasarımlar veya küçük peptitler) klinik öncesi PET ve SPECT ile karakterizasyonunu içeren çalışmaların sayısı literatürde hızla artış göstermektedir. Klinik öncesi görüntülemeden klinik pratiğe aktarılan ve translasyonel aşamada olan temel teranostik hedefler Tablo 2’de özetlenmiştir.

Sonuç ve Gelecek Perspektifleri

Sonuç olarak, yeni nesil teranostik radyofarmasötiklerin geliştirilmesinde klinik öncesi mikro-PET ve mikro-SPECT görüntüleme sistemleri, moleküler tasarımların in vivo dünyadaki kaderini belirleyen en güçlü translasyonel köprüdür. Hücre kültürlerinde (in vitro) yüksek stabilite gösteren bir ajanın, in vivo karmaşık biyolojik sistemlerde karaciğer veya tiroid gibi sağlıklı dokularda serbest radyonüklid (örneğin, serbest ¹²⁴I) birikimine yol açabileceğinin bu sistemlerle gösterilmesi, başarısız adayların erken evrede elenmesini sağlayarak klinik araştırmaların güvenliğini ve maliyet etkinliğini artırmaktadır. Ancak bu çalışmaların klinik translasyon değerini koruyabilmesi; cihaz kalibrasyonlarından anestezi protokollerine, doğru enjeksiyon yöntemlerinden ex vivo diseksiyon doğrulamalarına kadar uzanan katı preklinik standartların sağlanmasına bağlıdır.

Geçmişte PSMA ve FAP hedefli ajanların mikro-görüntüleme basamaklarını başarıyla tamamlayarak günümüz klinik pratiğinin rutin birer parçası haline gelmesi, bu metodolojik süzgecin doğruluğunu kanıtlamaktadır. Yakın gelecekte, translasyonel fazda olan Trop-2 ve Nectin-4 gibi umut vaat eden yeni hedeflere yönelik geliştirilen teranostik ajanların da preklinik moleküler görüntüleme süzgecinden geçerek kişiselleştirilmiş onkolojik yönetimde yerlerini alacağı ve nükleer tıp pratiğini daha da ileriye taşıyacağı öngörülmektedir.